Később családja is kiszabadult. Az 1550-es évek végén Dobó újabb birtokadományokra tett szert, köztük Léva vára és uradalma volt a legjelentősebb, ahová hamarosan rezidenciáját is áttette. Véglest zálogbirtokként szerezte meg, Göncöt és Telkibányát pedig megvásárolta, és ezzel bekerült a leggazdagabb magyarországi főurak közé. 1562-ben bányavárosi főkapitánnyá nevezte ki I. Ferdinánd. Feladata a bányavidék városainak és várainak megvédelmezése volt. A Habsburg-hű főúr kapcsolata a bécsi udvarral I. Ferdinánd király halála után megromlott. Ebben közrejátszott egy, a Magyar Kamara által ellene folytatott birtokper, valamint több más főúrral együtt abba a gyanúba keveredett, hogy át akarna térni az erdélyi uralkodó, Szapolyai János Zsigmond pártjára. A vád soha nem bizonyosodott be. Dobó élete végéig rendületlenül tagadta azt, és élettörténetén végigtekintve valóban nehezen képzelhető el, hogy Habsburg-ellenes összeesküvésben vett volna részt. Pozsony várában tartották fogva mintegy két évig.
Eger várának alapját a Szent István király által alapított püspöki székesegyház képezte, mely 1241-ben a tatárok áldozatául esett. A várat a XIII. század folyamán építették újjá, hogy az északi országrész védőbástyájává válhasson; az eredetileg román stílusú székesegyházat pedig gótikus, majd későgótikus stílusban építették újjá, mely a török időkig jelentős kulturális központként is működött. Gárdonyi Géza "egri csillagai", élükön Dobó István várkapitánnyal 1552-ben hősies (valószínűleg egy várvédőre eső 20-40 jól felfegyverzett katonával szembeni) küzdelemben voltak képesek megvédelmezni a magyarországi végvárakat sorra bekebelező töröktől Egert, s ezzel a XVI. században elsőként aratni felettük győzelmet. A vár későbbi, s részletesebb története az egri hős várkapitány nevét viselő múzeumban ismerhető meg, ahol a sírköve is található. Kiállítások: Az egri vár története, Képtár, Börtönkiállítás, Hősök terme, Kazamata, Romkert Szolgáltatások: Éremverde, Panoptikum, Ispotály-pince, Büfé, Ajándékbolt, Íjász pálya Múzeumi foglalkozások felsőtagozatosoknak és középiskolásoknak.
1572 áprilisában szabadult ki, miután hitlevélben fogadott ismételt hűséget az udvarnak. Hazatért szerednyei birtokára, ahol azonban hamarosan elhunyt. Holttestét Ruszka templomában helyezték örök nyugalomra. Sikereinek csúcsán, életének delén erdélyi vajdának is kinevezik, és annak alkonyán sötét börtönökben sínylődve szenvedte a "Habsburg-hálát" Márvány reneszánsz szarkofágját fia készítette és helyezte el a dobóruszkai templom szentélyében. A ma is itt látható síremlék oldallapjai eredetiek, a híres fedlap viszont csak másolat. Az eredeti márvány sírkőfedlap ma az egri Dobó István Vármúzeumban látható, a Hősök termében, kiegészítve az oldallapok másolatával és egy később a sírkőhöz került úgynevezett "rákfarkas" márványsisakkal. A fedlap igen kalandos úton került Egerbe, amit Mikszáth Kálmán is megemlít a Különös házasság című regényében. Dobó István maradványainak pontos helyét a dobóruszkai templomon belül egészen a legutóbbi időkig nem ismerték, és a régészek csak 2008-ban, mintegy kétéves kutatás után tudták teljes biztonsággal azonosítani.